一种水线草中耳草酮A的提取分离方法,其特征在于,包括以下步骤:1)将水线草用醇溶剂进行提取,得到水线草醇提物;2)将所得水线草醇提物分别用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯反复多次萃取;取乙酸乙酯萃取部位,浓缩得精提浸膏;3)将所述精提浸膏用甲醇超声溶解,过滤,滤液硅胶拌样后经正相硅胶柱层析,用洗脱剂进行梯度洗脱,收集洗脱液;所述洗脱剂为石油醚‑乙酸乙酯洗脱剂,和二氯甲烷‑石油醚洗脱剂;4)将步骤3)所得洗脱液采用柱层析分离法或制备液相分离法或刮板法进一步纯化,制得耳草酮A;所述柱层析分离法包括将步骤3)所得洗脱液采用葡聚糖凝胶柱层析,以甲醇作为洗脱剂进行洗脱,收集洗脱液,制得耳草酮A;或者所述柱层析分离法包括将步骤3)所得洗脱液经ODS反相柱层析,以甲醇作为洗脱剂进行洗脱,收集洗脱液,制得耳草酮A;所述制备液相分离法包括将步骤3)所得洗脱液进制备液相,以甲醇水为流动相进行洗脱,制得耳草酮A;所述制备液相采用LC‑3000高效液相ThermoC18(250×21.2mm)制备柱;所述刮板法包括将步骤3)所得洗脱液通过薄层硅胶板分离,制得耳草酮A。